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什么是細胞外囊泡?
細胞外囊泡 (EV) 是由細胞分泌的膜結合小顆粒,被認為具有細胞信使的功能,將貨物從一個細胞運送到另一個細胞。電動汽車有多種亞型,其功能、貨物和尺寸各不相同,直徑范圍為 ~30-1000 nm。最小的 EV 類型是外泌體,大小約為 30-150 nm。EV 起源于稱為多泡體 (MVB) 的細胞區室,其本身源自內體的內陷。當 MVB 與質膜融合并釋放其貨物時,囊泡被釋放。
在生物醫學研究中,外泌體及其貨物被用作癌癥和其他疾病的診斷生物標志物。EV 和外泌體可以使用超速離心、PEG 沉淀和免疫捕獲珠等技術從血液或其他生物體液中分離出來。
外泌體膜含有源自原始細胞質膜的跨膜蛋白,通常包括四跨膜蛋白家族的蛋白質(如 CD9、CD63 和 CD81)。在內部,外泌體包含細胞質成分,如蛋白質和 RNA。可以使用 RNAseq、蛋白質印跡和流式細胞術等方法分析外泌體成分。為了通過流式細胞術進行表征,研究人員可以使用染料對膜和核酸等外泌體成分進行染色,以及與四跨膜蛋白或其他感興趣的蛋白質結合的抗體。
外泌體分析:小目標,大挑戰
外泌體的小尺寸使其難以處理和分析。在流式細胞術中,外泌體很難與細胞碎片和其他小顆粒區分開來,它們的大小處于或低于某些流式細胞儀的靈敏度極限。用某些染料或抗體染色有助于區分外泌體和其他顆粒。然而,使用不會形成聚集體的染色劑很重要,因為這些小顆粒本身可能會與染色的外泌體混淆。這種聚集體一直是外泌體研究人員的挫敗感。
在分析之前用于富集或純化 EV 的方法也是一個重要因素。富含簡單 PEG 沉淀步驟的樣品通常含有大量非 EV 脂質顆粒,這些顆粒也可能與膜染料結合。這些雜質可以通過使用其他 EV 純化方法來減少,例如尺寸排阻色譜 (SEC) 或免疫沉淀。與抗四跨膜蛋白抗體結合的磁珠可以產生純外泌體簇。然而,這些珠子可能會與許多疏水性染料(例如膜染料)非特異性結合。
我們已經篩選了大量我們的抗體和染料,以尋找那些既能很好地染色外泌體,又表現出極少或沒有聚集(即在沒有外泌體的情況下發出信號)的抗體和染料。繼續閱讀下文,探索我們經過驗證的 EV 抗體和染料。
EXOBRITE™ EV 膜染色試劑盒
ExoBrite™ EV 膜染色試劑盒旨在克服外泌體檢測的一些挑戰。ExoBrite™ 染料與外泌體膜中的分子結合,通過流式細胞術為分離的 EV 提供明亮、特異性的染色。ExoBrite™ 染料的一個關鍵優勢在于,與許多其他染料不同,它們幾乎沒有或沒有與外泌體或 EV 大小相似的背景聚集體。此外,與大多數膜染料不同,ExoBrite™ 染料不會非特異性結合聚苯乙烯珠粒,這意味著它們可用于染色珠粒結合的外泌體。
ExoBrite™ EV 膜染色劑已在流式細胞術中得到驗證,能夠對來自多種不同培養細胞系的外泌體和 EV 進行染色,并通過多種不同方法進行分離,包括尺寸排阻色譜 (SEC)、聚乙二醇 (PEG) 沉淀和磁珠免疫沉淀 (IP)。
ExoBrite™ EV 膜染色優點:
專為外泌體染色設計和配制
極低的背景可提供出色的信噪比
能夠與抗體共同染色(不同于 CellBrite® Fix 或 MemBrite® Fix)
能夠與珠結合外泌體一起使用(與大多數其他膜染料不同)
來自 MCF-7 細胞的珠結合外泌體的流式細胞術。未染色的外泌體(灰色)或與 10X ExoBrite™ 490/515 和 CD9(H19a)-CF®568(粉色)共染色。在 FITC 和 R-PE 通道中的 CytoFLEX LX 流式細胞儀上檢測到外泌體。
ExoBrite™ EV 膜染色/抗體共染色
ExoBrite™ EV 膜染色劑的一項優勢是能夠與抗體共染色,用于外泌體蛋白質分析研究。共染色可以同時或順序進行,并且可以在純化的或珠結合的外泌體上進行。ExoBrite™ EV 膜染色劑是通用外泌體染色劑,應標記樣品中的所有外泌體*,允許使用抗體來量化表達目標蛋白質的外泌體數量。例如,在我們測試的外泌體(MCF-7 衍生)中,四跨膜蛋白 CD9 高度且無處不在地表達。** 我們發現,當我們與 ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain 和 CD9( H19a)-CF®488A,它們的陽性群體幾乎*重疊(見圖,右)。
純化外泌體最佳 ExoBrite™/抗體共染色的提示:
使用 10X ExoBrite™ 對 1 mL 中純化的外泌體進行染色(ExoBrite™ 染色在同時共染色期間會有所減少,因此不建議使用 1X)
嘗試從至少 0.1 ug/mL 的抗體開始
*在我們測試的外泌體中,ExoBrite™ EV 膜染色劑標記了所有外泌體。可能存在具有不同染色水平的外泌體類型。
**四跨膜蛋白(CD9、CD61 和 CD81)和其他蛋白質的表達水平在細胞類型和外泌體來源之間差異很大。
SEC 純化的 MCF-7 衍生外泌體同時使用 1 mL 10X ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain 和 0.1 ug/mL CD9(H19a)-CF®488A 染色。當對 ExoBrite™ 560/585 陽性顆粒進行門控時,約 95% 的 CD9 也呈陽性(頂行)。同樣,當對 CD9 陽性顆粒進行門控時,約 95% 的 ExoBrite™ 560/585 也呈陽性(底行)
經驗證的外泌體抗體
用作外泌體標志物的最常見蛋白質是四跨膜蛋白家族的成員 CD9、CD63 和 CD81。四跨膜蛋白是具有許多擬議功能的質膜蛋白,包括其他膜蛋白的活化和分選。它們還被認為在將蛋白質靶向多泡體 (MVB) 和外泌體方面發揮作用。這些四跨膜蛋白在許多細胞類型上廣泛表達,因此可以在許多類型的外泌體上檢測到,但它們的表達水平確實因細胞來源類型而異。
EV 中經常檢測到的其他蛋白質包括熱休克蛋白(即 HSP70)、膜運輸蛋白、MVB 生物發生蛋白(即 Alix、TSG101)和細胞粘附分子(即 Ep-CAM、ICAM-1)。Ep-CAM 主要在上皮細胞中表達,包括細胞系 MCF-7。
Biotium 提供多種不同的針對外泌體標記蛋白的抗體克隆,每種都有多種偶聯物選擇,例如亮 CF® 染料和生物素。下面列出的抗體已通過流式細胞術專門驗證用于外泌體檢測,使用富集的 MCF-7 衍生的 EV,結合 CD63 特異性磁珠 (Thermo Fisher Scientific)。
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